熒光定量PCR(qPCR)儀是分子生物學(xué)研究、臨床診斷(如新冠病毒檢測(cè))等領(lǐng)域的核心設(shè)備，其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。校正(校準(zhǔn))是確保qPCR儀性能穩(wěn)定的關(guān)鍵步驟，需定期對(duì)溫控系統(tǒng)(溫度控制精度)和光學(xué)系統(tǒng)(熒光信號(hào)檢測(cè))進(jìn)行系統(tǒng)性驗(yàn)證與調(diào)整。
一、校正的核心目標(biāo)
qPCR儀的校正旨在確保以下關(guān)鍵性能指標(biāo)符合要求：
溫控系統(tǒng)：溫度示值誤差(設(shè)定溫度與實(shí)際溫度的偏差)、溫度均勻度(反應(yīng)孔間溫差)、溫度波動(dòng)度(溫度隨時(shí)間的變化)、溫度最大過沖量(升溫/降溫過程中超出設(shè)定值的幅度)、平均升降溫速率(升溫/降溫的速度)。
光學(xué)系統(tǒng)：熒光強(qiáng)度精密度(同一孔熒光信號(hào)的一致性)、閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)精密度(不同孔Ct值的一致性)、熔解溫度(Tm值)漂移(熒光強(qiáng)度下降一半時(shí)的溫度偏差)、熒光線性相關(guān)系數(shù)(熒光強(qiáng)度與核酸濃度的線性關(guān)系)。
二、校正前的準(zhǔn)備工作
1. 環(huán)境條件
溫度：15–30℃(避免溫度波動(dòng)影響校準(zhǔn)結(jié)果)；
相對(duì)濕度：20–85%RH(防止儀器受潮)；
電源：穩(wěn)定電壓(建議使用UPS)，避免斷電影響校準(zhǔn)進(jìn)程。
2. 設(shè)備與材料
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：需使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA、核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，其特性量值(拷貝數(shù)≥10? copies/μL)及相對(duì)擴(kuò)展不確定度(≤5%)需符合JJF(津)04-2020要求；
校準(zhǔn)設(shè)備：光學(xué)模擬器(集成溫度傳感器與發(fā)射光發(fā)生器，溫度測(cè)量范圍0–120℃，最大允許誤差±0.1℃；發(fā)射光波長(zhǎng)360–780nm，相對(duì)光輻射強(qiáng)度可調(diào))、多通道溫度校驗(yàn)儀(如JDPC-96，用于測(cè)量反應(yīng)孔間溫差)；
耗材：專用校準(zhǔn)板(如AB7500 ROI校準(zhǔn)板、背景校準(zhǔn)板)、移液器(2μL、10μL等，需計(jì)量檢定合格)、無粉手套(防止污染校準(zhǔn)板)。
三、校正的主要流程
qPCR儀的校正流程需嚴(yán)格遵循JJF(津)04-2020《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范》，主要包括溫度系統(tǒng)校準(zhǔn)與光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn)兩部分，以下以AB7500系列儀器為例說明具體步驟：
?。ㄒ唬囟认到y(tǒng)校準(zhǔn)
溫度是qPCR反應(yīng)的核心參數(shù)，直接影響DNA擴(kuò)增效率。溫度系統(tǒng)校準(zhǔn)需使用光學(xué)模擬器(替代反應(yīng)管)，模擬實(shí)際反應(yīng)中的溫度變化，驗(yàn)證儀器的溫度控制性能。
1. 校準(zhǔn)前準(zhǔn)備
將光學(xué)模擬器與qPCR儀連接，確保下方溫度傳感器與上方熒光發(fā)射光源與儀器均熱塊接觸良好；
在光學(xué)模擬器下涂抹導(dǎo)熱油，增強(qiáng)熱傳導(dǎo)；
打開儀器軟件，選擇“校準(zhǔn)”模塊，進(jìn)入“溫度校準(zhǔn)”程序。
2. 校準(zhǔn)程序
預(yù)熱：設(shè)定儀器溫度為23℃，運(yùn)行預(yù)熱程序(約10分鐘)，使儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；
溫度點(diǎn)設(shè)置：選擇9個(gè)溫度點(diǎn)(30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃等)，每個(gè)溫度點(diǎn)持續(xù)2分鐘(用于測(cè)量溫度示值誤差、均勻度、波動(dòng)度)；
升溫/降溫過程：從50℃升溫至90℃(測(cè)量平均升溫速率)，再?gòu)?0℃降溫至50℃(測(cè)量平均降溫速率)；
數(shù)據(jù)采集：儀器自動(dòng)記錄每個(gè)溫度點(diǎn)的設(shè)定溫度(Ts)、實(shí)際溫度平均值(T?)、溫度波動(dòng)值(T_v)、最大過沖值(T_os)。
3. 結(jié)果計(jì)算
溫度示值誤差：△T = Ts - T?(要求≤±0.5℃)；
溫度均勻度：△Tu = T_umax - T_umin(T_umax為所有孔溫度最大值，T_umin為最小值，要求≤1.0℃)；
溫度波動(dòng)度：△T_v = ±(T_max - T_min)/2(T_max為單個(gè)孔溫度最大值，T_min為最小值，要求≤0.2℃)；
溫度最大過沖量：△T_os = Tosmax - Ts(Tosmax為所有孔過沖值最大值，要求≤3.0℃)；
平均升溫速率：v_up = (TB - TA)/tut(TB為90℃溫度點(diǎn)平均值，TA為50℃溫度點(diǎn)平均值，tut為升溫時(shí)間，要求≥4℃/秒)；
平均降溫速率：v_down = (TB - TA)/tdo(tdo為降溫時(shí)間，要求≥3℃/秒)。
?。ǘ┕鈱W(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn)
光學(xué)系統(tǒng)負(fù)責(zé)檢測(cè)熒光信號(hào)，其準(zhǔn)確性直接影響Ct值與核酸濃度的定量結(jié)果。光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn)需使用專用校準(zhǔn)板(如AB7500 ROI校準(zhǔn)板)，調(diào)整熒光檢測(cè)器的靈敏度與信號(hào)一致性。
1. 背景校準(zhǔn)
目的：消除儀器本底熒光(如電子信號(hào)、塑料耗材污染)的干擾；
步驟：
(1)取出背景校準(zhǔn)板(需室溫放置5分鐘，避免冷凝水)；
(2)將校準(zhǔn)板裝入儀器，運(yùn)行“背景校準(zhǔn)”程序(約30分鐘)；
(3)軟件自動(dòng)記錄背景熒光信號(hào)，生成背景校正文件(后續(xù)實(shí)驗(yàn)中自動(dòng)扣除)。
2. ROI（感興趣區(qū)域）校準(zhǔn)
目的：將反應(yīng)板上的孔位映射到儀器檢測(cè)器，確保每個(gè)孔的熒光信號(hào)準(zhǔn)確采集；
步驟：
(1)取出ROI校準(zhǔn)板(標(biāo)準(zhǔn)板或快速板，需渦旋5秒并離心2分鐘)；
(2)將校準(zhǔn)板裝入儀器，運(yùn)行“ROI校準(zhǔn)”程序；
(3)軟件自動(dòng)拍攝每個(gè)濾光片的圖像，生成ROI掩碼(每個(gè)孔周圍顯示綠色圓圈，表明校準(zhǔn)成功)；
(4)若圖像過飽和(孔內(nèi)熒光過強(qiáng))，需調(diào)整曝光時(shí)間(如從2048減少至1024)，重新采集圖像。
3. 光學(xué)校準(zhǔn)
目的：補(bǔ)償光學(xué)系統(tǒng)的物理效應(yīng)(如濾光片的光譜響應(yīng))，確保熒光信號(hào)的準(zhǔn)確性；
步驟：
(1)選擇“光學(xué)校準(zhǔn)”程序，加載ROI校準(zhǔn)文件；
(2)運(yùn)行程序(約10分鐘)，軟件自動(dòng)分析熒光信號(hào)的光譜特征，生成光學(xué)校正文件。
4. 染料校準(zhǔn)
目的：驗(yàn)證不同染料(如FAM、VIC、ROX)的熒光信號(hào)準(zhǔn)確性，確保多染料實(shí)驗(yàn)的可靠性；
步驟：
(1)取出染料校準(zhǔn)板(包含多種熒光染料，如CY3、CY5、FAM等)；
(2)將校準(zhǔn)板裝入儀器，運(yùn)行“染料校準(zhǔn)”程序；
(3)軟件自動(dòng)采集每個(gè)染料的熒光光譜，生成染料校正文件(后續(xù)實(shí)驗(yàn)中自動(dòng)識(shí)別染料信號(hào))。
?。ㄈ┙Y(jié)果記錄與證書
校準(zhǔn)完成后，需出具CNAS認(rèn)證的校準(zhǔn)證書，包含以下內(nèi)容：
(1)儀器基本信息(型號(hào)、序列號(hào)、生產(chǎn)廠家)；
(2)校準(zhǔn)環(huán)境條件(溫度、濕度、時(shí)間)；
(3)校準(zhǔn)結(jié)果(溫度示值誤差、均勻度、光學(xué)系統(tǒng)精密度等)；
(4)校準(zhǔn)人員與審核人員簽名；
(5)校準(zhǔn)機(jī)構(gòu)資質(zhì)(CNAS認(rèn)可編號(hào))。
四、校正的注意事項(xiàng)
1. 校準(zhǔn)周期
建議每12個(gè)月進(jìn)行一次全面校準(zhǔn)(符合JJF(津)04-2020要求)；
高使用頻率(如每天運(yùn)行10次以上)或關(guān)鍵應(yīng)用(如臨床診斷)下，可縮短至6個(gè)月一次；
儀器搬遷、維修或更換關(guān)鍵部件(如加熱塊、檢測(cè)器)后，需重新校準(zhǔn)。
2. 專業(yè)支持
校準(zhǔn)需由廠家工程師或具備資質(zhì)的第三方機(jī)構(gòu)(如天津市計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)科學(xué)研究院)執(zhí)行，確保符合SOP(標(biāo)準(zhǔn)操作程序)；
禁止非專業(yè)人員自行調(diào)整儀器參數(shù)(如溫度設(shè)置、光學(xué)濾光片)，以免影響校準(zhǔn)結(jié)果。
3. 校準(zhǔn)后的驗(yàn)證
校準(zhǔn)完成后，需運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(如質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，檢測(cè)Ct值的重復(fù)性(變異系數(shù)≤3%)與線性相關(guān)系數(shù)(R²≥0.99)，確保校準(zhǔn)效果；
若驗(yàn)證結(jié)果不符合要求，需重新校準(zhǔn)或聯(lián)系廠家維修。
五、常見問題與解決
1. 溫度均勻度不符合要求
原因：均熱塊污染(如殘留的PCR產(chǎn)物)、溫度傳感器老化；
解決：清潔均熱塊(用無水乙醇擦拭)，更換溫度傳感器。
2. 熒光信號(hào)強(qiáng)度低
原因：ROI校準(zhǔn)失敗(孔位映射錯(cuò)誤)、背景熒光過高；
解決：重新進(jìn)行ROI校準(zhǔn)，運(yùn)行背景校準(zhǔn)(更換背景校準(zhǔn)板)。
3. Ct值變異大
原因：溫度波動(dòng)度超標(biāo)(如加熱塊不穩(wěn)定)、熒光檢測(cè)器靈敏度下降；
解決：檢查加熱塊的溫度穩(wěn)定性(用多通道溫度校驗(yàn)儀測(cè)量)，更換熒光檢測(cè)器。
六、總結(jié)
熒光定量PCR儀的校正是確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵步驟，需嚴(yán)格遵循行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(如JJF1527-2015、JJF(津)04-2020)，定期對(duì)溫控系統(tǒng)與光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)過程中需注意環(huán)境條件、專業(yè)支持與結(jié)果驗(yàn)證，確保儀器的性能符合實(shí)驗(yàn)要求。通過規(guī)范的校正流程，可有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。
